Bijlage I Onderzoekingsregulatief 2002: , behorende bij het Onderzoekingsregulatief 2002

Onderzoekingsregulatief 2002

De Nieuwe Nederlandse Niertest (NNNT) is een testsysteem voor het aantonen van bacteriegroeiremmende stoffen in nierbekkenvocht van slachtdieren met behulp van Bacillus subtilis BGA als test organisme. Twee papierschijfjes geïmpregneerd met nierbekkenvocht worden op een voedingsbodem gelegd waarin voor bacteriegroeiremmende stoffen een gevoelige bacterie aanwezig is. Na incuberen wijst aanwezigheid van bacteriegroeiremmende werking rondom beide papierschijfjes op aanwezigheid van anti-microbiële stoffen. Bacillus subtilis BGA sporensuspensie, ca. 107/ml. Gebruikelijke instrumenten en glaswerk voor microbiologische laboratoria en in het bijzonder: Meet de diameter van de heldere remzones met inbegrip van de schijfjes van de standaardcontroleschijfjes en van de met nierbekkenvocht geïmpregneerde papierschijfjes. Noteer deze diameter in mm's op de daarvoor bestemde resultatenformulieren. Indien de remzones van de standaardcontroleschijfjes voldoen aan de door het RIKILT, pet batch, vastgestelde waarden is de NNNT juist uitgevoerd. De resultaten van de met nierbekkenvocht geïmpregneerde monsterschijfjes kunnen vervolgens geïnterpreteerd worden. Indien de diameter van beide heldere remzones met inbegrip van het schijfje groter of gelijk is aan 20 mm is de test positief. Indien er slechts bij één schijfje een dergelijke remzone te constateren valt, is de uitslag negatief. De diepgevroren papierschijfjes dienen tot 24 uur na de officiële keuringsuitspraak bij -20°C bewaard te blijven in verband met mogelijke herkeuring. Eventuele herkeuring dient te gebeuren met de diepgevroren schijfjes.

• 4.1. Standard II Nähragar (Merck art. nr. 7783).
• 4.2. Dextrose.
• 4.3. Natriumchloride p.a.
• 4.4. Natriumchloride-oplossing 0,8%
• 4.5. Natriumchloride-oplossing 10,0%
• 4.6. Zoutzuur 1 Mol. (Goed afsluiten van de buitenlucht).
• 4.7. Natriumhydroxyde-oplossing 1 Mol. Verse 1 Mol NaOH oplossing afvullen in goed afsluitbare 100 ml flesjes; na in gebruik name van een flesje deze maximaal twee weken gebruiken. In verband met carbonaatvorming in de NaOH, o.i.v. de CO2 uit de lucht, het flesje onmiddellijk na gebruik goed afsluiten. De carbonaten geven problemen bij de instelling van de juiste pH van de voedingsbodem.
• 4.8. Fosfaatbuffer. Monokaliumfosfaat (KH2PO4) 20,0 g. Dinatriumfosfaat (Na2HPO4.12H2O) 28,0 g. Gedestilleerd water 1000 ml.
• 4.9. Trimethoprimoplossing (TMP).
• 4.9.1. Trimethoprim base (SIGMA T-7833) 100 mg. Methanol 100 ml.
• 4.9.2. TMP-oplossing A (concentratie 10 µg/ml): Oplossing 4.9.1. 1 ml. Natriumchloride-oplossing 0,8% (4.4.) 100 ml. Bewaring in de koelkast gedurende maximaal 1 maand.
• 4.9.3. TMP-oplossing B (concentratie 2 µ/ml): Oplossing 4.9.1. 1 ml. Natriumchloride-oplossing 10% (4.5.) 500 ml. Bewaring in de koelkast gedurende maximaal 1 maand.
• 4.10. Standaardcontroleschijfjes. Controleschijfje 1:2 µg tylosine/schijfjes; Controleschijfje 2:0,5 µg sulfadimidine/schijfje; Controleschijfje 3:2 µg oxytetracycline/schijfje. Bewaren gedurende maximaal 3 maanden in de koelkast, onder goede afsluiting van de buitenlucht.
• 5.1. Glasplaten van 30 bij 30 cm met opstaande rand van 2,5 cm, met afdekplaat.
• 5.2. Infusieflessen van 250 ml en 500 ml.
• 5.3. Maatcylinder van 250 ml met 1 ml-verdeling.
• 5.4. Waterbad, ingesteld op 55°C ± 1°C.
• 5.5. Broedstoof ingesteld op 37°C ± 1°C.
• 5.6. Groot scherp slagersmes.
• 5.7. Papierschijfjes met een diameter van 12,7 mm (Schleicher en Schüll art. 601/2).
• 5.8. Plastic opbergdoosjes bevattende 24 cupjes van 15 mm doorsnede (Greiner art. 662160).
• 5.9. Micropipet van 25 µl of druppelaar (Nutacon MR35R) van 25 µl.
• 5.10. Filtreerpapier (47 x 57 cm Boom B.V. Meppel) voor afdekken van plaat met voedingsbodem.
• 5.11. Horizontale tafel, voor het gieten van de voedingsbodem.
• 6.1. Bereiding van het medium. Standard II Nähragar (4.1.): 12,5 g; Dextrose (4.2.): 5,0 g; Natriumchloride p.a. (4.3.): 5,0 g; Fosfaatbuffer (4.8.): 50 ml; Gedestilleerd water: 450 ml. Weeg de droge componenten af, voeg de fosfaatbuffer en het gedestilleerd water toe en los het geheel op door verwarming. Steriliseer het aldus bereide medium gedurende 15 min. bij 121 ± 1°C. Koel af tot ca 55°C in een waterbad van 55°C (5.4.) en stel de pH van het medium met zoutzuur (4.6.) of natriumhydroxide-oplossing (4.7.) op 7.00 ± 0,05.
• 6.2. Beënting en gieten van de voedingsbodem. Voeg per 100 ml steriele vers bereide voedingsbodem van ca 55°C 1,2 ml TMP-oplossing A (4.9.2.) en 0.1 ml B.subtilis sporensuspensie (3) toe. Meng goed en giet dit medium in horizontaal geplaatste platen (5.1.) zodanig dat de agarlaagdikte, over de gehele plaat 2,2 mm is. Voor deze glasplaten 200 ml per plaat. Laat stollen. Indien de tijdsduur tussen gieten en het gebruik van de testplaten meer dan 4 uur bedraagt, dienen deze tussentijds gekoeld bewaard te worden. Indien de testplaten binnen 4 uur gebruikt worden, is opslag bij kamertemperatuur mogelijk. De platen op de dag van inzetten bereiden.
• 7.1. Uitvoering van de test. Snij met een, onder stromend water gereinigd, slagersmes (5.6.) vanuit de nierschors tot diep in het nierbekken. Leg met een schone pipet vier papierschijfjes (5.7.) in het nierbekken of, bij kleine nieren, op de grens van nierbekken en niermerg. Nier dichtklappen en even aandrukken. Na minimaal 1/2 uur tot maximaal 2 uur, met een schone pipet, twee papierschijfjes uit de nier diagonaalsgewijs op de voedingsbodem (6.2.) leggen. (Ter vermijding van contaminatie bij elke nier een schone pincet nemen of deze tussentijds onder stromend water goed afspoelen). De twee andere papierschijfjes, voor eventueel herkeuringsonderzoek, worden overgebracht naar één cupje van een daartoe speciaal bestemd opbergdoosje (5.8.), geïdentificeerd en onmiddellijk ingevroren bij -20°C. Breng in het midden van de testplaat standaardcontroleschijfjes (4.10.) aan. Bij iedere testplaat controleschijfjes 1, 2 en 3 gebruiken. Druppel op de voedingsbodem gelegde papierschijfjes 25 µl TMP-oplossing B (4.9.3.). Dek de voedingsbodem af met een glasplaat. Ter voorkoming van condens kan gebruik gemaakt worden van filtreerpapier (5.10.) en een glasplaat. Zorg er voor dat het filtreerpapier niet de voedingsbodem raakt!!
• 7.2. Incubatie. De pre-incubatie mag max. 2 uur bedragen bij kamertemperatuur. Incubeer vervolgens de platen gedurende 13-18 uur bij 37°C. De platen tijdens de incubatie niet stapelen.