Bijlage II Besluit Protocollen hygiënevoorschriften pluimveeverwerkende industrie 1999: : Analysemethoden voor het aantonen van Salmonella en Campylobacter in pluimvee(vlees) en eieren

Besluit Protocollen hygiënevoorschriften pluimveeverwerkende industrie 1999

Voor het aantonen van Salmonella en/of Campylobacter in pluimvee(vlees) en eieren staat de pluimveesector een aantal analysemethoden ter beschikking, welke goedgekeurd zijn door de Raad voor Accreditatie. Het laboratorium kan deze analysemethoden toepassen voor de analyses in het kader van de Verordening Hygiënevoorschriften Pluimveehouderij 1999 en de Verordening Hygiënevoorschriften Pluimveeverwerkende industrie 1999. Het laboratorium dient dan wel de betreffende analysemethode onder haar accreditatie van de Raad voor Accreditatie (ISO/IEC 17025) onder te brengen. De analysemethoden zijn: Dit protocol beschrijft een methode voor het aantonen van Salmonella in dons, faeces (mest) en vellen en eindproduct afkomstig van pluimvee. De Raad voor Accreditatie heeft de methode goedgekeurd voor de matrix mest, dons, vellen en eindproduct. Salmonella: micro-organismen die de voor deze bacteriën karakteristieke groei vertonen en specifieke biochemische en serologische reacties vertonen wanneer wordt gekweekt respectievelijk getest volgens de beschreven werkwijze. Detectie van Salmonella: bepalen van de aan- of afwezigheid van deze micro-organismen als het onderzoek wordt uitgevoerd volgens de beschreven werkwijze. Na voorincubatie van de te onderzoeken matrix in een voorophopingsmedium, wordt geënt op een half-vast medium, waarna wordt afgestreken op een selectief isolatiemedium. Alle gebruikte grondstoffen en het gedestilleerde water moeten van analysekwaliteit zijn. gebufferd pepton water BPw bijlage 1.1 modified semi-solid Rappaport-Vassiliadis medium MSRV bijlage 1.2 briljant groen agar BGA bijlage 1.3 ureumagar UA bijlage 1.4 triple-sugar-ironagar TSI bijlage 1.5 lysine-decarboxylase medium LDC bijlage 1.6 De samenstelling en bereiding van media en reagentia is opgenomen in bijlage 1. Er mag echter ook gebruik gemaakt worden van media die commercieel verkrijgbaar zijn. Gebruikelijke apparatuur en glaswerk voor een microbiologisch laboratorium en in het bijzonder de onde

• 1. PVE Branchemethode MSRV voor het aantonen van Salmonella in dons, faeces, vellen en eindproduct afkomstig van pluimvee.
• 2. Alternatieve PVE Branchemethode ProbeliaTM PCR voor het aantonen van Salmonella in dons, faeces, vellen en eindproduct afkomstig van pluimvee.
• 3. Alternatieve PVE Branchemethode VIDAS SLM voor het aantonen van Salmonella in dons afkomstig van pluimvee.
• 4. PVE Branchemethode voor de bepaling van de aan- of afwezigheid van thermotolerante Campylobacter spp. in monsters pluimvee, pluimveeproducten en omgevingsmonsters.
• 5. PVE Branchemethode voor het aantonen van thermotolerante Campylobacter spp. met behulp van de VIDAS CAM test in pluimveeproducten.
• 5.1. Broedstoof voor het bebroeden bij 37 ° C ± 1 ° C
• 5.2. Broedstoof voor het bebroeden bij 42 ° C ± 0,5 ° C
• 5.3. Waterbad ingesteld op 47 ° C ± 2 ° C
• 5.4. Steriele entnaalden met een oog met een diameter van ca. 3 mm.
• 5.5. Steriele pipetten met een schaalverdeling van 0,1 ml en een meetvolume van 1 ml.
• 5.6. Petrischalen met een middellijn van ca. 9 cm.
• 5.7. Cultuurbuizen van 17/18 x 150 mm en van 8 x 160 mm.
• Positieve controle
• Negatieve controle
• Blanco controle
• NEN-EN 12824 Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders - horizontale methode voor het aantonen van Salmonella (ISO 6579:1993, gewijzigd).
• Zee, van der H., E. De Boer, P. Van Netten, 1990, Salmonella isolatie met behulp van MSRV, De Ware (n) chemicus 20: 189-199.
• Hartman, dr. E.G., Validatierapport van de isolatie van Salmonella uit de matrix pluimvee faeces m.b.v. het Modified Semi-solid Rappaport Vassiliadis (MSRV)-medium, september 1999
• Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting).
• Stel de pH, zodat deze na sterilisatie 7,2 ± 0,2 bedraagt bij 25 ° C.
• Verdeel het medium over daarvoor geschikte flessen.
• Steriliseer in een autoclaaf (15 min. 121 ° C).
• Los de ingrediënten op in het water.
• Breng het mengsel onder voortdurend schudden aan de kook (NIET AUTOCLAVEREN).
• Stel de pH op 5,2 ± 0,2.
• Koel het mengsel af tot 50 ° C.
• Los 10 mg novobiocine op in 2 ml gedestilleerd/demi water.
• Steriliseer de oplossing d.m.v. filtratie (filter 22 μ m).
• Voeg oplossing B toe aan 500 ml oplossing A.
• Meng de oplossing.
• Giet uit in petrischalen en verwijder de luchtbellen.
• Even aan de lucht drogen om een nat oppervlak te voorkomen.
• Los de ingrediënten op in het water (indien nodig via verhitting).
• Stel de pH, zodat deze na sterilisatie 7,0 ± 0,2 is.
• Schenk het medium in daarvoor geschikte buizen/flessen.
• Steriliseer in een autoclaaf (15 min. 121 ° C).
• Los de componenten op in ± 50 mI water.
• Vul met water aan tot een eindvolume van 100 ml.
• Verhit gedurende 20 min. in een waterbad van 70 ° C.
• Koel af tot 47 ° C ± 1 ° C.
• Gebruik de oplossing direct.
• Voeg het briljant groen (concentratie tussen 4,5 mg/l en 6 mg/l) toe aan het water.
• Bewaar de oplossing tenminste 1 dag in het donker zodat auto-sterilisatie optreedt.
• Voeg, onder aseptische omstandigheden, oplossing C toe aan de (tot 47 ° C ± 1 ° C) afgekoelde oplossing B.
• Voeg deze oplossing toe aan oplossing A en meng het medium.
• Giet het vers bereide medium in grote (± 40 ml) of in kleine petrischalen (±15 ml).
• Laat de platen stollen.
• Droog de platen voor gebruik.
• Los de ingrediënten op in het water.
• Stel de pH op 6,8 ± 0,2 bij 25 ° C en filtreer de oplossing.
• Steriliseer de oplossing gedurende 15 min bij 121 ° C in een autoclaaf.
• Laat de oplossing afkoelen tot 47 ° C.
• Los de ureum op in het water
• Steriliseer de oplossing d.m.v. filtratie en controleer de steriliteit.
• Voeg oplossing B (ureumoplossing) toe aan oplossing A (basismedium).
• Verdeel het medium over steriele buizen, per buis 10 ml medium.
• Laat de buizen stollen zodat een schuin gedeelte ontstaat.
• Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting).
• Stel de pH, zodat deze na sterilisatie 7,4 ± 0,2 is.
• Verdeel het medium over buizen, per buis 10 ml medium.
• Steriliseer de oplossing gedurende 15 min bij 120 ° C in een autoclaaf.
• Laat de buizen stollen zodat er bovenop 2,5 cm agar onderin de buis, een schuin gedeelte ontstaat.
• Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting).
• Stel de pH, zodat deze na sterilisatie 6,8 ± 0,2 is.
• Verdeel het medium over smalle reageerbuizen; per buis 5 mI medium.
• Steriliseer in een autoclaaf (10 min. 121 ° C).
• 5.1 Broedstoof voor het bebroeden bij 37 ± 10 C
• 5.2 Micropipetten (5-50 en 20-200 μl)
• 5.3 Microcentrifuge voor 1,5 ml centrifugebuisjes (max. 10.000-15.000 rpm)
• 5.4 Verhittingsblokken of waterbaden ingesteld op 56± 1 °C en 100 ± 1 °C
• 5.5 Bio-Rad iCycler thermocycler voor PCR
• 5.6 Bio-Rad microtiterplaat shaker/incubator Model Stat-Fax
• 5.7 Bio-Rad microtiterplaat washer Model PW-40/41
• 5.8 Bio-Rad microtiterplat reader Model 550 met 450 nm en 620 nm filters
• 5.9 Stomacherzak met filter
• 5.10 Steriele centrifuge buisjes 1,5 ml
• 5.11 Steriele micropipetpunten met filter
• 5.12 Steriele PCR-tubes 200 μl
• Positieve controle
• Negatieve controle (indien een ingangscontrole per batch wordt toegepast, kan deze negatieve controle komen te vervallen)
• Blanco controle
• Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting)
• Stel de pH, zodat deze na sterilisatie 7,2 ± 0,2 bedraagt bij 250 C
• Verdeel het medium over de daartoe geschikte flessen
• Steriliseer in een autoclaaf (15 min. , 1210 C)
• Broedstoof voor het bebroeden bij 37 ° C ± 1°C
• Broedstoof voor het bebroeden bij 42 ° C ± 0,5°C
• Micropipet (500 μl)
• Steriele micropipetpunten
• Waterbad (1000 C) of equivalent
• Steriele entnaalden met een oog met een diameter van ca. 3 mm.
• Steriele pipetten met een schaalverdeling van 0,1 ml en een meetvolume van 1 ml.
• Petrischalen met een middellijn van ca. 9 cm.
• Cultuurbuizen van 17/18 x 150 mm en van 8 x 160 mm.
• Stomacherzakken (met filter)
• VIDAS analyse apparaat
• Positieve controle
• Negatieve controle (indien een ingangscontrole per batch wordt toegepast, kan deze negatieve controle komen te vervallen)
• Blanco controle
• de gevolgde methode;
• de gegevens die noodzakelijk zijn voor de identificatie van het monster;
• de gevolgde methode van monsterneming, indien bekend;
• het resultaat volgens hoofdstuk 8;
• eventuele bijzonderheden die tijdens de bepaling zijn waargenomen die het resultaat kunnen hebben beïnvloed.
• Positieve controle zie boven
• Negatieve controle
• Blanco controle
• Positieve controle
• Negatieve controle (indien een ingangscontrole per batch wordt toegepast, kan deze negatieve controle komen te vervallen)
• de gevolgde methode;
• de gegevens die noodzakelijk zijn voor de identificatie van het monster;
• de gevolgde methode van monsterneming, indien bekend;
• het resultaat volgens hoofdstuk 8;
• eventuele bijzonderheden die tijdens de bepaling zijn waargenomen die het resultaat kunnen hebben beïnvloed.
• 1. Eerstelijnscontrole van de methode
• Positieve controle zie boven
• Negatieve controle
• 1. Niet-selectief voorophopingsmedium
• 5.1 iCycler Thermal Cycler met 96-wells reactiemodule (Bio-Rad cat. #: 170-8720)
• 5.2 iCycler iQ Optical Module (Bio-Rad cat. #: 170-8740)
• 5.3 iCycler iQ Filter set Texas Red/ Rox Dyes (Bio-Rad cat. #: 170-8781)
• 5.4 Stomacher
• 5.5 Broedstoof voor het bebroeden bij 37 ± 1°C
• 5.6 Verhittingsblok voor 1,5 ml buizen (100 ± 1°C)
• 5.7 Tafelcentrifuge (maximaal 12.000 rpm, voor 1,5 ml buizen)
• 5.8 Vortex
• 5.9 Magnetische roerder
• 5.10 20 μl, 200 μl and 1000 μl micropipetten
• 5.11 Combi-tips pipetten
• 5.12 iCycler iQ 96-well PCR platen (Bio-Rad cat. #: 223-9441)
• 5.13 iCycler iQ Optical sealing tape (Bio-Rad cat. #: 223-9444)
• 5.14 200 ml 8-strip tubes (Bio-Rad cat. #: 223-9469)
• 5.15 200 ml 8-strip caps for 200 μl tubes (Bio-Rad cat. #: 223-9472)
• 5.16 Stomacher zakken met filter
• 5.17 1 ml en 10 ml pipetten
• 5.18 Steriele filtertips, passend op 20 μl, 200 μl en 1000 μl micropipetten
• 5.19 1,5 ml Eppendorf SafeLock buisjes
• 5.20 Combi-tips tips, steriel, individueel verpakt
• 5.21 2 ml and 5 ml steriele buizen of flesjes
• 5.22 Poeder-vrije handschoenen
• 5.23 Milli-Q of gedestilleerd steriel water
• 5.24 Ethanol 96% of NaOH 5%
• Gebruik specifieke, gescheiden sets laboratorium benodigdheden zoals pipetten en buizen voor bijvoorbeeld DNA extractie en de bereiding van PCR mix.
• Het is van groot belang dat gebruik wordt gemaakt van een positieve en negatieve controle in elke serie van amplificatie reacties ('PCR run').
• Gebruik geen reagentia waarvan de houdbaarheidsdatum is verstreken.
• Homogeniseer reagentia voorafgaand aan gebruik.
• Controleer regelmatig de nauwkeurigheid en precisie van alle pipetten en apparatuur.
• Verwissel handschoenen met enige regelmaat, vooral indien contaminatie wordt verondersteld.
• Voer periodieke reiniging uit van de werkplaats met tenminste 5% bleekmiddel.
• Vermijdt gebruik van latex handschoenen met poeder. Voorkom vingerafdrukken op het optisch sealing tape.
• Schrijf niet op de dopjes van PCR-buizen. In beide gevallen zal de real-time data- acquisitie hinder ondervinden.
• Homogenizeer 25 g monster in 225 ml gebufferd pepton water, in een stomacher zak met filter.
• Incubeer zonder schudden gedurende 18-20 uur bij 37 °C.
• Pipetteer 1 ml ophoping met een disposable pipet in een 1,5 ml Eppendorf buis (voorkom pipetteren van grote fragmenten van monsterresten). Schudt de ophoping niet voorafgaand aan het pipetteren van het monster.
• Een monster wordt negatief beschouwd voor Salmonella indien geen Ct-waarde voor FAM is toegekend, en de interne controle (Texas Red) een Ct-waarde > 10 heeft.
• Indien de interne controle ook geen Ct-waarde is toegekend (Ct = N/A), dan is interpretatie van het resultaat onmogelijk. Een dergelijk resultaat kan een indicatie zijn van remming van de PCR reactie. In dit geval dient het monster (DNA-extract) 1/10 verdund te worden in steriel gedestilleerd water en moet de PCR reactie worden herhaald.
• Positieve controle
• Negatieve controle (indien een ingangscontrole per batch wordt toegepast, kan deze negatieve controle komen te vervallen)
• Blanco controle
• 1. Samenstelling van het voorophopingsmedium
• 2. Samenstelling iQ Check™ Salmonella test kit
• Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting)
• Stel de pH, zodat deze na sterilisatie 7,2 ± 0,2 bedraagt bij 25 °C
• Verdeel het medium over de daartoe geschikte flessen
• Steriliseer in een autoclaaf (15 minuten, 121 °C)